Microbiosymas.com
Análisis de las comunidades bacterianas mediante secuenciación del gen 16S ARNr en un ambiente de producción de melón
Los melones, que han sido responsables de un número creciente de brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos, pueden contaminarse con patógenos microbianos durante la producción. Sin embargo, hay poca información disponible sobre las poblaciones microbianas en el entorno de las huertas de melones. El propósito de este trabajo fue caracterizar las comunidades bacterianas presentes en las huertas de melón. Se recolectaron enjuagues de frutas, tierra y cosechadores de dos huertas de melón, cada una visitada tres veces. El análisis del microbioma se realizó mediante la secuenciación de 16s ARN y se analizó utilizando el programa qiime2. Se determinaron correlaciones entre el tipo de muestra y las poblaciones microbianas. El análisis de diversidad identificó 2777 secuencias en todas las muestras. Las muestras de suelo tuvieron el mayor número y diversidad de especies únicas (de 130 a 1329 OTU); melón (de 112 a 205 OTU) y manos (de 67 a 151 OTU) tenían una diversidad similar. En conjunto, Proteobacteria fue el Phyla más abundante (del 42 al 95%), seguido de Firmicutes (1-47%), Actinobacteria (<1 al 23%) y Bacteroidetes (<1 al 4.8%). Los géneros más abundantes fueron Acinetobacter (20-58%), Pseudomonas (14.5%), Erwinia (13%) y Exiguobacterium (6.3%). Los géneros con potencial patógeno incluyen Bacillus (4%), Salmonella (0.85%), Escherichia-Shigella (0.38%), Staphylococcus (0.32%), Listeria (0.29%), Clostridium (0.28%) y Cronobacter (0.27%), que se encontraron en frecuencias más bajas. Este estudio proporciona información sobre el microbioma de producción de melón, que puede ser base para que se puedan resolver problemas críticos de seguridad alimentaria, como la resistencia a los antimicrobianos, la virulencia y la epidemiología genómica.
Mas información en: Franco-Frías. E., V. Mercado, J.A. Merino-Mascorro, J. Perez-Garza, N. Heredia, J. Dávila-Aviña, J. Leon, L.A. Jaykus and S. García. 2021. Analysis of bacterial communities by 16S RNAr gene sequencing in a melon producing agroenvironment. Microbial Ecology. 82: 613-622. https://doi.org/10.1007/s00248-021-01709-8
Antimicrobianos naturales y sintéticos reducen la adhesión de Escherichia coli enteroagregativa y enterohemorrágica a células epiteliales.
Existen varios microorganismos como Escherichia coli que con frecuencia ocasionan enfermedades por el consumo de alimentos. Las cepas patógenas de E. coli se agrupan en patotipos dependiendo de los factores de virulencia que poseen y sus mecanismos de acción, la bacteria E. coli serotipo O104:H4 (EAHEC por sus siglas en inglés, perteneciente al patotipo enteroagregativo-enterohermorrágico) es considerada una cepa híbrida compartiendo factores de virulencia de cepas de los patotipos enteroagregativo (EAEC) y enterohermorrágico (EHEC), y es considerada altamente patógena, ya que los factores de virulencia de los dos patotipos convergen en ella, y mas aún, a que el antibiótico de primera elección para tratar a los pacientes, la rifaximina, ha mostrado en algunos casos un aumento en la patogénesis, incrementando la producción de algunos factores de virulencia, agravando el estado de los pacientes y reduciendo las alternativas terapéuticas.
En trabajos previos en nuestro laboratorio demostramos que algunos compuestos naturales como el carvacrol (compuesto mayoritario de especies de orégano), y la brasilina (compuesto presente en el árbol palo de brasil [Hb]), tenían gran actividad contra patotipos de E. coli abriendo un área de oportunidad como alternativa de control, por lo que la profundización de su estudio era por demás necesario. Dado que el proceso de adhesión de la bacteria a las células blanco es el primer paso, y uno de los críticos para el desarrollo de enfermedad al facilitar su internalización y por consiguiente el desarrollo del proceso patológico, en este trabajo se analizó el efecto de antimicrobianos naturales y sintéticos (carvacrol, oregano, brasilina, palo de brasil y rifaximina) sobre la adherencia de EHEC O157:H7, EAEC 042, y EAHEC O104:H4 a células eucarióticas (HEp-2) y sobre la expresión de algunos genes involucrados en este proceso.
Se analizaron 2 concentraciones de cada antimicrobiano que no afectaran (p≤0.05) la viabilidad celular o provocaran un daño en la integridad de la envoltura bacteriana. Se establecieron diferentes ensayos con las bacterias y la línea celular a fin de establecer si los antimicrobianos podían afectar la adhesión por su efecto sobre las células HEp-2, o sobre la bacteria, e incluso determinar si eran capaces de revertir la unión establecida entre célula eucariótica-bacteria o bien si el efecto podía modificarse después de varios ciclos de adhesión. Se utilizó la tinción de Giemsa para determinar los patrones de adhesión y qPCR para determinar los niveles de expresión de genes relacionados con la virulencia de la bacteria y con el estrés oxidativo de las células HEp-2 cuando se agregaban los compuestos antimicrobianos. Los resultados obtenidos mostraron que los antimicrobianos analizados redujeron la adhesión de la bacteria a las células HEp-2 hasta el 65% (p≤0.05). El carvacrol (10 mg/ml) fue el compuesto más activo contra la cepa EHAEC O104:H4, alterando incluso su patrón agregativo. Se observaron cambios en la expresión de los genes estudiados relacionados a la adhesión (aggR, pic, aap, aggA, and eae), así como en genes relacionados al estrés oxidativo de células eucarióticas (SOD1, SOD2, CAT, y GPx). Se estableció que los compuestos afectaron la adhesión cuando se agregaban a la bacteria y no a células HEp-2. Adicionalmente se determinó que el efecto de inhibición de la adhesión bacteria-célula HEp-2 disminuía con el paso de generaciones bacterianas.
En resumen, con este trabajo se demostró que el carvacrol, el extracto de orégano y la rifaximina a concentraciones muy bajas (que no afectan la viabilidad de la bacteria) son capaces de interferir con sitios blanco, reduciendo la eficiencia de adhesión de la bacteria a la célula eucariótica, brindando evidencia sólida sobre la efectividad de estos compuestos para afectar la patogenicidad de esta bacteria y brindando alternativas viables de tratamientos eficaces para los problemas que estos microorganismos provocan.
Finalmente, este trabajo contribuyó a la formación de estudiantes de licenciatura y posgrado, ayudando de esta manera en forma integral al avance científico en el área, y enfrentando a estudiantes a la resolución de problemas reales, que pueden contribuir en la mejora de la salud de nuestro país.
Mas información en: Ortiz Y., A. García-Heredia, A. Merino-Mascorro, L. Solís-Soto, S. García and N. Heredia. 2021. Natural and synthetic antimicrobials reduce adhesion of enteroaggregative and enterohemorrhagic Escherichia coli to epithelial cells. PLOS One. 16(5). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0251096
Bacteroidales como alternativa confiable para determinar contaminación fecal en frutas y hortalizas
Existen bacterias que tradicionalmente se usan como indicadoras de contaminación fecal de alimentos. Sin embargo, estas no son muy efectivas ni indican el origen animal o humano de la contaminación. En el orden Bacteroidales existen bacterias intestinales que conservan secuencias específicas de huésped (animal o humano), y se ha sugerido su posible uso como indicadores alternativos para predecir el origen de la contaminación fecal en alimentos. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia de Bacteroidales específicos de huésped para identificar el origen de contaminación, la persistencia de Bacteroidales en la superficie de frutas y hortalizas, el efecto de condiciones ambientales sobre su persistencia y la existencia de correlación entre Bacteroidales y los indicadores de contaminación tradicional. Se contaminaron muestras de tomates, fresas y melones previamente descontaminadas con heces que contenían Bacteroidales específicos de humanos, cerdo y bovino (106 a 107 UFC/100 ml) o los indicadores fecales tradicionales (FIB por sus siglas en inglés) E. coli, coliformes totales y Enterococcus (a concentraciones que se encuentran normalmente en las heces). La cuantificación microbiana fue determinada inmediatamente después de la inoculación o bien, se determinó su persistencia después de almacenar los vegetales en dos condiciones ambientales que normalmente se utilizan para el almacenaje de hortalizas (10ºC con 95% de humedad relativa y 25ºC con 65% de humedad relativa) hasta por 20 días. Los FIB se enumeraron por los procedimientos de recuento estándar, en tanto que para Bacteroidales fue por qPCR, en donde se obtuvo un rango de detección de 1.35 a 10.35 log de copias genómicas (equivalente a 2 células de Bacteroidales). Nuestros resultados indicaron baja correlación entre presencia de FIB y de Bacteroidales. Cuando las determinaciones se realizaron inmediatamente después de la inoculación en vegetales, los niveles detectados de Bacteroidales fueron mayores que los de las FIB, y los valores de las FIB fueron muy variables, siendo por lo tanto los Bacteroidales mejores indicadores para la detección de contaminación fecal que las FIB tradicionales. La detección de Bacteroidales específicos de diferentes huéspedes fue similar a la de los coliformes totales cuando se inocularon >0.1 mg de heces sobre el vegetal. Cuando se analizó la persistencia de FIB y Bacteroidales en los vegetales se encontró que las FIB no tuvieron un patrón definido y variaron en las condiciones de almacenaje mientras que los niveles de Bacteroidales mostraron estabilidad con el tiempo (P≤0.01) a ambas condiciones de almacenaje estudiadas. Todos los Bacteroidales analizados fueron detectados en todas las muestras en niveles que fueron de 1.2 to 6.7 logUFC/vegetal durante todo el tiempo de almacenamiento a ambas condiciones estudiadas. Con todo lo anterior, podemos concluir que el uso de Bacteroidales representan una alternativa en conjunto con las FIB o incluso en lugar de ellas para detectar contaminación fecal en vegetales, ya que se mantienen estables en los vegetales en diferentes condiciones de almacenamiento por periodos de tiempo prolongados.
Mas información en: Ordaz, G., A. Merino, S. García and N. Heredia. 2019. Persistence of Bacteroidales and other fecal indicator bacteria on inanimated materials, melon and tomato at various storage conditions. International Journal of Food Microbiology 299: 33-38. Doi: 10.1016/j.ijfoodmicro. 2019.03.015 y en Merino-Mascorro, J.A., L. Hernandez-Rangel, N. Heredia and S. García. 2018. Bacteroidales as indicators and source trackers of fecal contamination in tomatoes and strawberries. Journal of Food Protection 81: 1439-1444. Doi: 10.4315/0362-028X.JFP-18-073
Control de la Virulencia de Escherichia coli Enterohemorrágica y Enteroagregativa mediante Antimicrobianos Naturales
Varios grupos de Escherichia coli son capaces de causar enfermedades con alta mortalidad en el humano. Algunas variantes de los grupos conocidos, en particular el serotipo O104:H4, han causado estragos multinacionales. Se han desarrollado tratamientos físicos, químicos o terapéuticos para controlar la presencia de estos microorganismos en alimentos o en las enfermedades que causa, sin embargo, debido a su eficacia incompleta y a las tendencias actuales también se está contemplando como alternativa el uso de compuestos naturales antimicrobianos. La capacidad de esas E. coli patogénicas para causar infecciones se facilita por los mecanismos bacterianos que permiten la colonización y persistencia en diferentes ambientes, sin embargo, se conoce poco del efecto de antimicrobianos naturales sobre la expresión de sus factores de virulencia y los genes involucrados. En este trabajo se estudió la actividad del orégano Mexicano (Lippia berlandieri), del palo de Brasil (Haematoxylon brassiletto, Hb), así como sus principales componentes antimicrobianos (carvacrol y brasilina respectivamente), además de un control a base de cítricos y un antimicrobiano sintético, sobre el crecimiento, la movilidad tipo swarming, la producción de biopelículas, así como la expresión de genes de virulencia [stx2 (toxina Shiga), pic (mediador de colonización) y rpoS (relacionado con la respuesta al estrés] de E. coli enterohemorrágica (EHEC) O157:H7, E. coli enteroagregativa (EAEC) cepa 042, y la cepa de E. coli productora de Shiga toxina EAEC de serotipo O104:H4. La actividad antimicrobiana de los compuestos se determinó por el método de microdilución. Todos los extractos analizados mostraron actividad contra las cepas probadas con concentraciones mínimas bactericidas (CMB) que fueron de 0.08 to 8.1 mg/ml. La movilidad tipo swarming se analizó en agar suave Luria Bertani (LB), en donde la mayoría de los compuestos redujeron la movilidad entre 7 y 100%, con excepción del carvacrol el cual promovió este tipo de motilidad en dos de las cepas probadas. Los estudios de formación de biopelículas se realizaron en placas de microtitulación utilizando la coloración de cristal violeta. En forma general, la rifaximina inhibió el crecimiento y redujo la formación de biopelícula, sin embargo, a ciertas concentraciones, los otros compuestos analizados indujeron la formación de biopelícula. El ensayo de PCR de tiempo real mostró que la mayoría de los compuestos disminuyeron la expresión de stx2 (toxina Shiga). La expresión de los genes pic (mediador de colonización) y rpoS (relacionado con la respuesta al estrés) se suprimió en E. coli 042, sin embargo, en la cepa E. coli O104:H4 presentó un comportamiento variable dependiendo de los compuestos agregados. En general los compuestos mostraron un efecto bactericida contra las cepas, sin embargo, cuando se analizaron concentraciones subletales (debajo de las CMBs) los efectos observados variaron fenotípica y genotípicamente, sugiriendo que existe gran variabilidad entre las cepas estudiadas. En conclusión, los extractos analizados pueden afectan el crecimiento de E. coli, la movilidad tipo swarming, la formación de biopelícula y la expresión de genes de virulencia, sin embargo, a ciertas concentraciones son también capaces de incrementar la expresión de estos genes. Por lo que resulta importante mantener una dosis apropiada. Adicionalmente, al demostrarse una susceptibilidad variable de las cepas, se establece que se debe determinar el serotipo presente para aplicar medidas de control específicas.
Mas información en: Garcia-Heredia, A., S. Garcia, J.A. Merino-Mascorro, P. Feng, and N. Heredia. 2016. Natural plant products inhibits growth and alters the swarming motility, biofilm formation, and expression of virulence genes in enteroaggregative and enterohemorrhagic Escherichia coli. Food Microbiology. 59:124-132. doi:10.1016/j.fm.2016.06.001
El ambiente agrícola del cultivo de melón es reservorio de genes de virulencia y resistencia a los antibióticos.
Los melones contaminados con patógenos han provocado muchos brotes y enfermedades importantes. Dado que los genes de virulencia bacteriana pueden actuar en conjunto con la resistencia a los antibióticos y los elementos genéticos móviles, es necesario evaluar estos reservorios de genes en productos frescos de nuestro entorno, como los melones. El objetivo de este estudio fue evaluar la distribución de genes de resistencia a antibióticos, virulencia y elementos genéticos móviles en el ambiente de producción de melón en nuestro país. Se recolectaron un total de 200 muestras de melones variedad cantalup (N = 99), manos de trabajadores agrícolas (N = 66) y agua de la producción (N = 35). En cada muestra se analizó la presencia de 14 genes de resistencia a antibióticos, 15 genes de virulencia y cinco genes de elementos genéticos móviles mediante PCR. Nuestros resultados indicaron que con frecuencia se detectaron genes de resistencia a la tetraciclina (tetA, tetB) (18% de melón, 45% de muestras de manos) y sulfonamida (sul1) (30% de melón, 71% de muestras de manos). El gen de resistencia a la colistina (mcr1) se detectó en el 10% de las muestras de melón y el 23% de las manos de los trabajadores agrícolas. Entre los genes de virulencia, los genes invA y spiA de Salmonella fueron los más abundantes. Hubo una probabilidad significativamente mayor de detectar genes de elementos genéticos móviles, virulencia y resistencia a los antibióticos en las manos en comparación con las muestras de agua. Estos resultados demuestran la presencia de un grupo diverso de genes de virulencia y resistencia a los antibióticos en la producción de melón.
Mas información en: Perez-Garza, J., S. García, L-A. Jaykus, J. Leon, E. Franco and N. Heredia. 2021. The cantaloupe farm environment has a diverse genetic pool of antibiotic-resistance and virulence genes. Foodborne Pathogens and Disease. 18 (7) DOI: 10.1089/fpd.2020.2900.